桑黄是自-然界中十分珍稀的药用真菌,多糖是这个内里主要药效成份了。桑黄多糖拥有优良的抗肉.提升肌体免役才气等结局，动物实检查明一定桑黄多糖是通过增强机体抵抗力而到达抗肉结局了。
桑黄属于担子菌亚门( Basidiomycotina) .层菌纲( Hymenomycees).非褶菌目( Polporaceae).锈革孔菌科( Hymenochaetaceae) . 木层孔菌属( Phellinus) ;按种分主要有裂蹄针层孔菌Phellinm linteus, 火木层孔菌Phellinus igniarius 和鲍氏层孔菌Phellinus baumiiPilai-4)了。P.linteus 主要疏散于韩国,而P.igniaris和P.baumi主要疏散于我国国内了。
关于桑黄中多糖钻研的刚最先.最为所有一些是.P.linteus,从上世纪最先,韩国对其菌种.菌丝体发酵.菌丝体多糖的提取分散.结构,活性及结局机理做了一五一十的钻研一了。而国内对桑黄多糖,尤为是桑黄蘭丝体多糖的钻研对应起步较晚,且许多有关桑黄菌丝体多糖的文献报道中对桑黄菌菌种的种名及菌种起源交待不清,给桑黄菌丝体多糖的体制钻研带来了难题了。氧化损害是许多慢症,如肉.心肌病的诱因,抗氧化活性成份能够或者者防止细胞因自-由基结局而被老化.损害或者发生DNA结构更改,从而到达守护机体结局了。因而对人体平安的活性氧消除剂钻研拥有主要意义了。本文选择祖国微动物菌种收藏治理委员会普通微动物中心的桑黄菌菌株(Phellinusigniarius ,编号5.0095 )举行发酵获取菌丝体，优化了菌丝体多糖的提取条件,并对该菌丝体多糖的理化性子和抗氧化活性举行钻研,为桑黄菌丝体多糖的体制钻研和对比供应警戒了。
1原料与办法
1.1 原料与仪器
桑黄菌( Phellinus igriarius ,菌株编号5.0095)祖国微动物菌种收藏治理委员会普通微动物中心了。以PDB培育基液体种子培育,发酵培育基由小麦粉51.6 g/L. 麸皮13.8 g/L. 桑枝粉10 g/L. KH,PO.1 g/L.MgSO, .7H,O0.5 g/L组成,自-然pH了。将种子液接至发酵培育液中，接种量为10%.装瓶量100 mL/250 mL;于28 C转速135 r/min摇床中培育5 d,搜集菌丝体,清洗.冻干了。
氯化硝基四氮唑(NBT)南 京生兴动物技术公司;吩嗪甲酯硫酸盐( PMS ).还本型辅酶( NADH) Sigma公司;考马斯亮蓝G-250.牛血纯真卵白.无水乙醇.葡萄糖.浓硫酸.苯酚碘.碘化钾.a-萘酚.酒石酸钠钾均为AR级.上海 国药公司;水为两次蒸馏水了。
H1850R高速冷冻离心机湖南湘仪试验室仪器开拓有限公司;ALPHA2-4冷冻缓慢机德国.CHRIST; Varian Cary 100紫外分光光度计美国VARIAN ;NEXUS傅立叶红外分光光度计美 国热电尼高力了。
1.2.2桑黄多糖得率盘算
采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标-准品,测定总糖含量";采用考马斯亮蓝法,以牛血纯真卵白为标-准品,测定卵白质含量了。
1.2.3桑黄多 糖提取单原因试验
1.2.3.1提取时刻
准确称取桑黄菌丝粉各0.5 g,按料液比1:20( g/mL)参与蒸馏水，于100 C水浴分-别提取0.5. 1.0.1.5.2.0.2.5 h, 过滤，滤液定容至250 mL,测定总糖含量.盘算得率了。
1.2.3.2提取温度的选择
准确称取五份桑黄菌丝粉各0.5 g,按料液比1:20(g/mL) 加人燕馏水，分-别在60.70.80 .90 ,100 C水浴中提取2.0 h,过滤,提取液定容至250 mL,测定总糖含量.盘算得率了。
1.2.3.3提取料液 比的选择
精致称取五份桑黄菌丝粉各0.5 g.于100 C条件下，分-别根据1:5.1:10.1:15.1:20.1:25( g/mL)的料液比提取2.0 h,过滤,滤液定容至250 mL,测定总糖含量.盘算得率了。
1.2.3.4提取次数的选择
精致称取五份桑黄菌丝粉各0.5 g,按料液比为1:15(g/mL)加人蒸馏水,于100 C下提取2.0 h.分-别提取1.2.3.4.5次,合并滤液压缩,定容至250 mL,测定总糖含量.盘算得率了。
1.2.3.5桑黄水提取液总糖得率盘算
水提取物总糖得率(%) =总糖含量x稀疏体积/样板干质量x 100了。
1.2.4桑黄菌丝体多糖提取的正交试验计划在单原因试验的普遍,采用三原因三水平,按L了。(3')正交计划举行桑黄菌丝体多糖热水提取正交试验，以总糖得率做为照应值,各原因水平如表1所示,每一组试验均重复3次了。
1.2.5桑黄菌丝体多糖基本理化性子剖析
1.2.5.1桑黄多糖的化学性子检查
视察桑黄菌丝体多糖的表-面及在水和有机溶剂中熔解性,与碘-碘化钾反映.(-萘酚反映和斐林试剂反映，参照文献举行了。
1.2.5.2紫外光谱检测
将浓度为 1 mg/mL的桑黄菌丝体多糖溶液稀疏一定倍数后，在190-400 nm扫描了。
1.2.5.3红外光谱检测
5mg桑黄多糖冻干样板..KBr压片后,在400-4000cm-的中红外区扫描了。
1.2.6桑黄菌丝体多糖体外抗氧化活性
1.2.6.1消除超氧负离 子的测定
将桑黄菌丝体多糖用Tris- HCI缓冲液( pH8.0, 16 mmol/L)熔解,制成区别浓度的样板溶液了。NBT了。NADH均用Tris-HCI缓冲液( pH8.0, 16 mmol/L) 熔解，浓度分-别为300.468 umol/L; PMS用蒸馏水熔解,浓度为60 umol/L了。取1.50mL区别浓度的样板溶液，0.50mLNBT,0.5mLNADH,混匀,然后参与0.5mLPMS,空缺对比是将样板换为1.50mL的缓冲溶液了。操做办法一样，25C水浴5min后,在波长560nm下测定吸光度，每一样板平行测定三次了。超氧负离子消除率I的盘算公式以下四:
式中: 1为样晶对超氧负离子的消除率( Scavenging efect);A为样板尝试值,A了。为空缺对比值了。
1.2.6.2消除羟基自-由基的测定
将桑黄菌丝体多糖用去离子水熔解,配制成一排列区别浓度的样板溶液用了。用无水乙醇熔解邻两氮菲,配制浓度为0.75 mmol/L的邻两氮菲溶液,取1.0 mL邻两氨菲溶液分-别加人0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH7.40)2.0 mL.和蒸馏水1.0 mL,于漩涡混淆器足够混匀后,加人浓度为0.75mmol/L硫酸亚铁溶液1.0 mL,混匀,最终参与0.01% H2O2 1.0 mL,37(C水浴反映60min后,于波长536nm处测定吸光度,损害管测得的吸光度值记号为A了。样板管以1.0mL样板取代损害管中1.0 mL蒸馏水,操做办法与上述一样,样板管测得的吸光值记号为A2了。未损害营用1.0 mL蒸馏水取代损害管中的H2O,操做办法与上述一样,未损害管测得吸光值记号为A,了。每一样板平行测定三次了。羟基自-由基消除率1的盘算公式以下
式中:1为样板对羟基自-由基的消除率( Scavenging efeet) ;A,为损害管尝试值,A2为样板管尝试值,A,为未损害管尝试值了。
1.2.6.3还本才气的测定
将桑黄菌丝体多糖用去离子水熔解,制成一排列区别浓度的样板溶液,备用了。取1.0mL样板溶液,加人2.5mL铁氰化钾(1% )和2.5 mL PBS(0.2 mol/L, pH6.6) ,混淆平均后于50 C水浴反映20 min了。然后再加人2.5 mL三氯乙酸(体积分数为10% )混匀了。离心(3000 r/ min,10 min),吸收.上清液2.5 mL, 加人0.5 mL FeCI,(0.1% )混淆,于波长700 nm处测定吸光度了。以样板溶液的浓度为横坐标，获得的吸光度值为纵坐标绘制曲线了。
1.3 数据统计剖析
数据以著士表现,采用SPSS17.0软件体制举行数据剖析了。
2结局与讨论
2.1总糖和卵白含量测定标-准曲线的建设
采用苯酚-硫酸法,在490nm处测定吸光度值，总糖的标-准曲线:Y = 0.0064X - 0.0028(R" =0.9970) ,线性范围为10~ 100 μg了。
采用考马斯亮蓝法，在595nm处测定吸光度值,卵白的标-准曲线: Y = 0.0135X + 0.0795(R2 =0.9978) ,线性范围为10~60 μg了。
苯酚-硫酸法测定的是可溶性糖，包罗单糖.低聚糖和水溶性多糖等了。桑黄菌丝体中的单糖.双糖.低聚糖等易溶于水，在热水提取初始即溶于水中,而份子量较大的多糖对应难溶了。因而,多糖的溶出量是决定水提取液总糖得率主要原因了。为了简化测定历程,本文在优化多糖提取工艺时,采用总糖得率为指-标,最终将在最优工艺条件下提取的总糖经积淀，复溶8000 D透析袋透析,获得多糖,冻干称重,盘算多糖得率,测定这个内里多糖和卵白含量了。
2.2提取时刻对桑黄菌丝体总糖得率的影响
提取时刻对总糖得率的影响见图1了。在0.5~2.0h时,得率随着提时刻的延伸而增添;到2.0h以后,随着时刻的连续延伸，总糖得率的增添分明平
缓了。綜合思考能耗和时刻原因,选提取时刻为2.0h了。
2.3提取温度对桑黄菌丝体总糖得率的影响
提取温度对总糖得率的影响如图2所示,随着温度的逐逐步渐提高,多糖的含量逐逐步渐增添了。温度提高会致使份子动能增添,从而提升溶剂的熔解才气和渗透才气,增添多糖的溶出了。一样平常来说，温度越高提取结局越好，有相关报道以为一样平常中药选取滚水浴煎煮,因而提取温度选为100 C了。
2.4料液比对桑黄菌丝体总糖得率的影响
由图3可见,随着料液比的增添,总糖得率缓慢增添了。这是由于在传质历程中,提取剂增添，溶液中糖浓度被稀疏,固液两相间糖浓度差增添,从而加速传质速率了。但当料液比大于1:15(g/mL)时,总糖得率的增添已不分明，而过大的料液比会组成溶剂的糟蹋及能量消耗，且加重后续压缩的困难了。因而选择料液比为1:15(g/mL)了。
2.5提取次数对桑黄菌丝体总糖得率的影响
提取次数对总糖得率的影响见图4,总糖的得率随提取次数的增添而增大了。初始增添提取次数时,得率分明增添,由于每一次提取都采用新颖溶剂,菌丝体细胞与新颖溶剂之中的浓度差,推进多糖的溶出了。提取次数增添至2次时，得率为14.4% ;3次时,多糖得率到达16.37% ;再连续增添提取次数,多糖得率已无分明增添,声明多糖以前基本提取完全了。思考到每一增添--次提取带来的溶剂及能量消耗和后续压缩措施工做量的增添,将提取次数选定为2次了。
2.6 正交试验
在单原因试验的普遍,选取提取时刻.提取温度和料液比3个原因做为考察指-标,采用L了。(3*)正交试验计划.提取次数牢固为2次,举行优化桑黄菌丝体多糖的提取工艺条件,正交试验结局见表2,方差剖析见表3了。
由表2中R值可见,影响总糖得率的原因主次依次是:提取时刻(A) >提取温度(B) >料液比(C)了。由k值长短可知，优化工艺组合是A,B,C,.由方差剖析(表3)一样能够看出提取时刻这一原因结局最分明,次要是提取温度,最终是料液比了。
根据正交试验得出的最优计划A,B,C,, 即提取时刻2.5 h, 提取温度100 C,料液比1:15,3次平行试验，总糖得率分-别为14.19%.14.23%和14.08%，平均含量为14.17%，
将在最优计划下提获取到的桑黄水提取液，以80%乙醇积淀，于4C安置12h后,离心,积淀复溶.透析冷冻缓慢,称重,粗多糖得率为6.64% ,这个内里多糖含量69.29% , 卵白含量3.20%了。
2.7桑黄多糖化学性子检查
提取的桑黄菌丝体多糖.通过透析.冻干后,表观出现为白色松散状粉末,无聊，易溶于水，难溶于甲醇,乙醇,乙醚等有机溶剂了。碘-碘化钾反映呈阴-性,讲明桑黄粗多糖中不含淀粉;a-恭酚反映呈阳-性，讲明所得桑黄粗多糖中含有糖类物质;斐林试剂反映出现为阴-性.讲明桑黄粗多糖中不含游离单糖了。苯酚-硫酸法测定该桑黄菌丝体多糖中多糖含量为67.89%，卵白含量为3.59%了。
2.7.1紫外光谱检测
紫外1描图谱如图5所示,桑黄菌丝体多糖在196 nm处有分明的吸收峰，体现为糖的特色吸收;扫描260 nm处有吸收峰,体现为核酸的特色吸收,280nm处有少许的吸收，讲明有少许的卵白了。
2.7.2红外光谱检测
桑黄菌丝体多糖的红外光谱图如图6所示了。
图6展现桑黄菌丝体多糖拥有一样平常多糖在红外光谱中的希奇结构:在3385 cm 差一点有较强的0-H和N-H仲缩振动,2930cm~'处有C-H伸缩振动,这两组吸收峰是糖类物质的特色吸收峰;1880-1550cm'之中为C = O的伸缩振动，1650-1500 cm"'之中为N-H的变角振动,1250~950em-之中存在的吸收峰为吡喃环结构的吸收峰，声明该糖链构型为吡喃型了。
2.8桑黄菌丝体多糖的体外抗氧化活性
2.8.1消除超氧负离子的活性测定
桑黄菌丝体多糖和维生素C(V.)对超氧负离子的消除才气见图7了。在0.01~0.2mg/mL浓度范围内,随着浓度的逐逐步渐增添,多糖消除超氧负离子的才气缓慢增强了。当多糖浓度为0.2 mg/mL时，消除率到达最高,为49.49%了。而Vc浓度为0.1 mg/ mL时消除率以前到达92%,与之对比，多糖对超氧负离子的消除率对应较低了。
2.8.2消除羟基自-由基的活性测定
在 Fenton体制中H,O,与Fe'+反映发生羟基自-由基.OH,.OH将邻两氮菲-Fe'氧化变成邻两氮非-Fe'',致使溶液的色发生转变,在536nm处的吸收消逝或者削弱,而拥有消除OH才气的物质可与邻两氬菲竞赛OH,使得536nm处的吸收削弱水平缩小，故由该吸光度值的转变可测定羟基自-由基的消除率了。
桑黄菌丝体多糖和V了。对羟基自-由基的消除才气见图8了。在0.05~0.4 mg/mL浓度范围内，该多糖对羟基自-由基的消除率随着浓度的增添而逐逐步渐增大,浓度为0.2mg/mL时，消除率为28.7%,当浓度为0.4mg/mL时,消除率到达50%;与Ve对比，桑黄菌丝体多糖羟基自-由基的消除率较低了。这应该是由于Vc为小份子的抗氧化剂,自身拥有很强的抗氧化活性,不仅能直-接消除.OH,还能阻断Fenton反映,减少体制中OH的发生了。而关于大份子的多糖来说，OH必须与多糖碳氢链上的氢簿本联形成水才气被消除.因而桑黄的各组分多糖消除.OH的活性较差了。
2.8.3还本才气的测定
还本才气是检测隐藏抗氧化剂抗氧化活性的主要指-标了。测定理由以下，当反映体制中存在拥有还天性物质时，铁氰化钾被还本成亚铁氰化钾，在酸性条件下亚铁氰化钾与三氯化铁反映，变成在波长为700nm处有最大吸收峰的物质,测得的吸光度值越大,则表现该还天性物质的还本才气越强了。
桑黄菌丝体多糖的还本力测定结局见图9A.V了。的还本力测定结局见图9B了。由图可知，在0.1~1.0 mg/mL浓度范围内，桑黄菌丝体多糖的还本力与浓度之中拥有很好的量效关系,你们都随浓度的增添而逐逐步渐增添了。当浓度为1.0 mg/ml时，多糖的还本力为0.095,桑黄菌丝体多糖的还本才气与Ve对比均对应较羽,应该是由于多糖是大份子物质,这个内里包罗的还天性末尾对应较少了。
3结局
本试验通过单原因试验和正交试验,采用热水提取桑黄菌丝体多糖,试验结局讲明,影响桑黄菌丝体多糖提取率的三个因索的先后顺着纪律是:提取时刻>提取温度>料液比了。综合思考各原因获得优工艺参数为:提取时刻2.5 h, 提取温度100 C,料液比1:15(g/mL) .提取2次,在该条件下桑黄菌丝体多糖的平均提取率为6.64%了。该桑黄菌丝体多糖为白色松散粉末,无聊，易溶于水,不含淀粉和游离单糖,多糖含量为69.29%， 卵白含量为3.20%了。浓度为0.2mg/mL的桑黄菌丝体多糖对超氧负离子的消除率为49.49%,对羟基自-由基的消除率为28.7%,还本力为0.072,均低于Vc对应应的抗氧化才气了。
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